16S 基础知识、点亮皇冠分析工具和分析流程详解
本文摘要:工作中有个真理:如果你连自己所做的工作的来龙去脉都讲不清楚,那你是绝对不可能把这份工作做好的。 这适用于任何行业。如果你支支吾吾,讲不清楚,那么说难听点,你在混日子,没有静下心来工作。 检验标准:随时向别人解释你的工作,让别人提出尖锐的问

工作中有个真理:如果你连自己所做的工作的来龙去脉都讲不清楚,那你是绝对不可能把这份工作做好的。

这适用于任何行业。如果你支支吾吾,讲不清楚,那么说难听点,你在混日子,没有静下心来工作。

检验标准:随时向别人解释你的工作,让别人提出尖锐的问题,看你是不是答不上来。

16S概念

什么是16S?S是什么意思?

16S分析是用来干嘛的?能分析什么?

16S大致的分析原理是什么?

有点生物学基础的会知道16S和核糖体有关,但大多数还是搞不清楚它们之间的关系。

先明确一些概念:

核糖体:Ribosome,由 RNA(rRNA)和蛋白质 组成,配合 tRNA 来翻译 mRNA。核糖体按沉降系数来分类,S就是沉降系数,原核70S,真核80S。我们一般研究微生物,70S,由50S和30S两个亚基组成。再细分为 5S、16S、23S,我们的 16S 就是指核糖体的亚基的一个组分,16S rRNA。(记住,这是原核生物核糖体的一个组分)

16S rRNA:这并不是我们的研究对象,因为我们测序的不是它,而是它对应在DNA双链上的基因序列,

16S rDNA。可以这样理解,我们所说的16S 就是指 16S rDNA。

分子钟:即氨基酸在单位时间以同样的速度进行置换。16S 的进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝,5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中,约1.5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列,故被细菌学家和分类学家接受。(来源百度)

所以,16S测序的大致逻辑就是:

拿到一个样品,我们捕获其16S区域(引物PCR),然后测序,16S既然有极好的保守性,那就可以用于鉴别不同的物种(相当于一个物种的独一无二的条形码)(有很大一部分是鉴定不到物种的)。

分析逻辑就是聚类成OTU,然后注释(比对已知数据库),后续分析。

偶然看到一篇好的科普文,转载一下:来自

1、16S

通常所说的16S是指16S rDNA(或16S rRNA),16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约1542bp,包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能反映物种间的差异。

因16S rDNA分子大小适中,突变率小,故成为细菌系统发育和分类鉴定最常用的标签。

16S测序是指选择16S rDNA某个或某几个变异区域,选择通用引物对环境样本(肠道、土壤、水体等)微生物进行PCR扩增,然后对PCR产物进行高通量测序,并将得到的测序数据与已有的16S rDNA数据库进行比对分析,从而对环境群落多样性进行研究,核心是物种分析,包括微生物的种类,不同种类间的相对丰度,不同分组间的物种差异以及系统进化等。

16S rDNA序列结构 2、OTU

OTU即Operational Taxonomic Units的缩写(千万表手滑写成OUT,否则就OUT了),在系统发生学或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,属,种、分组等)设置的同一标志。理论上一个OTU代表一个微生物物种。

通过测序获得的大量reads,如何才能转变为我们需要的物种信息呢?首先需要对这些reads进行归类(cluster),通常在97%的相似水平划分为不同的OTU,将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Silva、RDP、Greengene等),得到每个样本所含的物种信息,进而进行后续生物信息统计分析。 3、Q值

Q值评估用来测序的碱基质量,Q值与测序错误E值之间关系为如果一个碱基的Q值为20,那表示这个碱基的可能测错的可能性为1%。实际操作中常用Q20/Q30作为标准,Q20大于90%妥妥的。

4、Coverage

Coverage值是指各样本文库的覆盖率,数值越高,则样本中序列被检测出来的概率越高,该数值可反映本次测序结果是否代表样本的真实情况。数值越接近于100%,代表本次测序结果越符合样本中微生物的实际情况。 5、Alpha-diversity

Alpha多样性用于度量群落生态单样本的物种多样性,是反映丰富度和均匀度的综合指标。

菌群丰富度(Community richness)指数有:Chao、Ace,Chao或Ace指数越大,说明菌群丰富度越高。  

菌群多样性(Community diversity)指数有:Shannon、Simpson,Shannon值越大,说明群落多样性越高;Simpson指数值越大,说明菌群多样性越低。

根据各样本生成的OTU,对样本序列进行随机取样,以取出的序列数及这些序列所能代表的OTU数构建曲线,计算样本的Alpha多样性。

通常Alpha多样性指数均以表格形式呈现,这显然不利于论文颜值的提升,那么可以将Alpha多样性指数结合起来,出个箱线图(Box-plot)或可有所帮助。

6、Beta-diversity

Beta多样性用于不同生态系统之间多样性的比较,利用各样本序列间的进化关系及丰度信息来计算样本间距离,反映样本(组)间是否具有显著的微生物群落差异。目前应用比较多的是PCA、PCoA、NMDS分析等。由于微生物多样性研究通常会涉及到大样本数量的样本,因此通过Beta-diversity分析可以直观地反映样本组间的差异情况。距离越远,微生物群落差异越大,即相似性越高。 7、LEfSe

LEfSe分析即LDA Effect Size分析,多用于多个分组(≧2)之间的比较,或者进行亚组比较分析,进而找到组间在丰度上有显著差异的物种(biomaker)。

基本过程是首先在多组样本中采用非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种;然后基于获得的显著差异物种,利用成组的Wilcoxon秩和检验进行组间差异分析;最后采用线性判别分析(LDA)对数据进行降维并评估差异显著的物种的影响力大小(即LDA score)。

LEfSe分析包含了不同分类学水平(门到属或者种)的物种信息,并且是显著差异的物种,因而是一项信息量大、采用率(biger)高的分析,值得拥有~~~

16S分析流程

建库测序暂且跳过,一下是我们拿到测序数据后的分析步骤:

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聚类OTU Cluster

分类Taxonomy

多样性Alpha_Beta

。。。

Hiseq 的 16S分析流程已经比较成熟了,网上能搜到一些pipeline。

PacBio的 16S分析是最近才开发出来的。

参考文章:High-resolution phylogenetic microbial community profiling

以下是该文章的分析流程:

皇冠国际:16S 基础知识、点亮皇冠分析工具和分析流程详解